Un nuevo estudio aporta pruebas convincentes del papel esencial de las cilicinas en el desarrollo y la fertilidad de los espermatozoides
By Vijay Kumar Malesu Nov 30 2023 Reviewed by Danielle Ellis, B.Sc.
En un estudio reciente publicado en eLife, un grupo de investigadores investigó el papel de las ciclicinas en la espermiogénesis y la fertilidad masculina en ratones y humanos mediante la edición génica de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas (CRISPR)/proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9).
Antecedentes
La espermiogénesis, que transforma las espermátidas redondas en espermatozoides, implica procesos complejos como la condensación del ácido desoxirribonucleico (ADN) y el desarrollo del acrosoma y el flagelo, que dependen en gran medida de un citoesqueleto espermático especializado. La teca perinuclear (PT), un componente crítico de este citoesqueleto, está compuesta por varias proteínas, entre ellas la cilicina 1 (Cylicin 1, Cylc1) y la cilicina 2 (Cylicin 2, Cylc2).
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Es necesario seguir investigando para comprender plenamente las complejas funciones de las cilicinas en la espermiogénesis, dada su participación decisiva en la arquitectura de la cabeza del espermatozoide y la fertilidad masculina, así como su estructura proteica única y su conservación evolutiva en todas las especies.
Acerca del estudio
En cumplimiento de las leyes alemanas de protección animal y las directrices institucionales, se llevaron a cabo experimentos con ratones deficientes en Cylc1 y Cylc2 tras recibir las aprobaciones necesarias. Estos ratones modificados genéticamente se crearon utilizando la tecnología CRISPR/Cas9 en cigotos B6D2F1. Se emplearon dos métodos distintos: microinyección de ácidos ribonucleicos de guía única (sgRNAs) y ARN mensajero (ARNm) Cas9 para Cylc1, y electroporación de complejos ribonucleoproteicos (RNP) para Cylc2. Se determinaron los genotipos de las crías y se aislaron los alelos editados mediante retrocruzamiento con ratones C57Bl/6J. Estas líneas se registraron y mantuvieron para estudios posteriores.
La extracción de ADN genómico se realizó por el método HotShot y se efectuaron reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) para el genotipado. Los machos de estas líneas se sometieron a análisis de fertilidad, incluido el apareamiento con hembras C57Bl/6J y el seguimiento de la preñez y el tamaño de la camada. Se recogieron muestras de esperma para realizar diversos análisis, como evaluaciones de concentración, viabilidad, motilidad y morfología, siguiendo los protocolos establecidos. Se extrajo ARN del tejido testicular para realizar una transcripción-PCR inversa cuantitativa (qRT-PCR), centrándose en la expresión de Cylc1 y Cylc2.
Se aislaron fracciones proteínicas subcelulares de espermatozoides para su análisis mediante western blot. Se realizaron estudios proteómicos mediante el método SP3, seguidos de análisis de los péptidos por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). La microscopía de alta resolución y la microscopía electrónica de transmisión (MET) proporcionaron información detallada sobre la estructura y la morfología de los espermatozoides.
Se analizaron los índices evolutivos de los genes de la ciclina para comprender su conservación y variación en las distintas especies de mamíferos. El estudio también incluyó una cohorte de más de 2030 hombres con problemas reproductivos, en la que se realizó la secuenciación del exoma completo para identificar variantes genéticas raras en CYLC1 y CYLC2. Los datos de estos pacientes se analizaron rigurosamente, siguiendo las directrices del American College of Medical Genetics and Genomics - Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP), para discernir cualquier posible relación con la infertilidad.
La secuenciación de Sanger validó las variantes identificadas, y se examinaron muestras de esperma humano siguiendo las directrices de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y tinciones de inmunofluorescencia. Se realizaron análisis estadísticos de todos los experimentos, garantizando una interpretación y validación rigurosas de los datos.
Resultados del estudio
La investigación sobre las cilicinas ha revelado varios hallazgos significativos en relación con su papel en la espermatogénesis y la fertilidad, tanto en ratones como en humanos. Se ha observado que la deficiencia de ciclicina provoca el desprendimiento del acrosoma de la envoltura nuclear (NE) durante la fase de tapón de la biogénesis del acrosoma. Este efecto refleja el desprendimiento del acroplaxoma de la membrana nuclear externa observado en la pérdida de CCIN, otra proteína crucial para el complejo Membrana Acrosomal (IAM)- PT- Envoltura Nuclear (NE). Se especula que las cilicinas, posiblemente junto con la CCIN, forman un "pegamento molecular" necesario para el anclaje del acrosoma.
Además, la deficiencia de Cylicin en ratones provocó otros defectos morfológicos notables en los espermatozoides maduros, como la elongación excesiva de la mancheta, su desmontaje retardado y la formación de huecos inusuales en la PT a nivel del anillo perinuclear. Se cree que estos defectos se deben a fallos en el transporte intra-manchette (IMT), un proceso crucial para el transporte de proteínas durante la espermiogénesis. Los resultados indican que las cilicinas podrían desempeñar un papel en el mantenimiento de la integridad y el contacto entre las regiones caudal y apical del PT.
El análisis evolutivo de los genes Cylc1 y Cylc2 en primates y roedores mostró que ambos están sometidos a selección purificadora, estando Cylc1 ligeramente menos controlado que Cylc2. Esta observación condujo a la hipótesis de que la pérdida de Cylc1 podría ser menos grave y podría ser compensada por Cylc2 debido a una redundancia parcial. En ratones macho, la deficiencia de Cylc1 provocó subfertilidad, mientras que la pérdida de ambos alelos de Cylc2 provocó infertilidad, lo que apoya esta hipótesis. Además, los machos Cylc2+/- conservaron la fertilidad, lo que sugiere que un único alelo funcional Cylc2 podría compensar la pérdida de Cylc1, aunque se requieren al menos dos alelos funcionales para la plena fertilidad masculina.
El estudio también observó que la tasa evolutiva de la región C-terminal rica en lisina de las Ciclinas es muy variable, fluctuando entre sitios de codones conservados y positivamente seleccionados. Los propios residuos de lisina están muy conservados, lo que indica que los cambios en la región C-terminal podrían conferir una ventaja adaptativa.
En los casos humanos, los defectos morfológicos del esperma y la infertilidad observados en un paciente con variantes en ambos genes Cylicin corroboran los hallazgos en ratones. La ausencia de CYLC1 y la localización alterada de CCIN en el esperma del paciente sugieren que las proteínas PT desempeñan funciones similares en humanos y roedores. Sin embargo, el estudio reconoce la posibilidad de discrepancias entre especies y la necesidad de seguir investigando para confirmar las implicaciones de estas variantes en la infertilidad humana.
Por último, el estudio menciona un caso en el que el padre de una paciente heredó la variante CYLC2 missense pero no experimentó infertilidad completa, aunque informó de dificultades en la concepción natural. Esta observación sugiere un efecto potencial de las variantes heterocigotas patogénicas de CYLC2 sobre la fertilidad. La investigación subraya la necesidad de una mayor identificación y caracterización de los pacientes con variantes de CYLC1 y CYLC2 para extraer conclusiones más definitivas sobre su impacto en la espermiogénesis y la infertilidad.
